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用液氮冷凍真空保存犢牛睪丸原質細胞

點擊次數(shù):1924 更新時間:2017-05-25

犢牛睪丸細胞作為多種病毒增殖的基質,已經(jīng)應用在疫苗生產(chǎn)中,并有廣泛的開發(fā)前景,但是由于產(chǎn)犢季節(jié)的不均衡,給生產(chǎn)帶來了困難,為了使生產(chǎn)不受季節(jié)影響,同時為了避免由保存原代細胞量大、細胞復活率低的問題,做了用液氮冷凍保存犢牛睪丸原質細胞的試驗。

1 材料與方法

1.1犢牛睪丸 出生三天內(nèi)的,未食初乳的本地黑白花公奶牛。

1.2細胞冷凍液的配制

冷凍液Ⅰ號:按本實驗室設計的方法配制,配方略。

冷凍液Ⅱ號:按常規(guī)方法配制,即含20%特牛血清,含5%~10%二甲基亞礬的營養(yǎng)液。

1.3待凍存細胞的制備

1.3.1原質細胞的制備:將犢牛睪丸細胞經(jīng)一定方法處理后,即在原質細胞自己接加入細胞凍存液中待凍,一般一對牛犢睪丸制備的原質細胞可分裝于3~5個安瓶中。

1.3.2原代細胞的制備:按常規(guī)方法消化犢牛睪丸,制得細胞懸液,放置37℃溫室培養(yǎng),3~4天形成致密單層后,按常規(guī)法消化、洗滌、離心,收集細胞泥,分別加入適量的細胞冷凍液,待凍。

1.3.3次代細胞的制備:將原代細胞按常規(guī)方法消化、培養(yǎng),得次代細胞單層,再按上述方法收集細胞泥,加入適量細胞冷凍液,待凍。

2 細胞的冷凍

將上述加入細胞冷凍液Ⅰ號或Ⅱ號液的原質細胞、原代細胞、次原代細胞的細胞瓶,放置4℃、30分鐘,再移到-50℃~-70℃冰箱中預冷2小時,然后迅速移到液氮罐中。

3 細胞復蘇

將安瓶自液氮罐中取出,立即放入38-40℃溫水中,使細胞在1分鐘內(nèi)融化,無菌吸出細胞懸液,加入新的生長液,將細胞稀釋成50萬個細胞/ml,37℃培養(yǎng)4小時,細胞貼壁后換液一次,繼續(xù)增減形成單層細胞。

4 結果與討論

實驗結果如下:

 

 

備注:

1 每批凍存細胞凍前都有正常細胞培養(yǎng)對照,以確定細胞消化成功與否。

2 凍存細胞復活率是指復蘇后細胞數(shù)/凍前活細胞數(shù)比值。

3 細胞生長情況批復蘇后37℃培養(yǎng)4天時細胞生長的致密情況。

4 復蘇后的細胞接毒培養(yǎng)后,均能有效帶毒,同正常培養(yǎng)細胞無差別。

從上表可以看出:

1 用凍存方法保存牛睪丸原質細胞,方法是可行的,這給應用牛睪丸細胞增值病毒的生產(chǎn)和試驗帶來了極大的方便,有利于適當安排生產(chǎn),同時給器官細胞的保存提供了可靠的依據(jù)。

2 從上表可見應用本實驗室配制的細胞凍存液凍存的細胞,復蘇后的存活率要比正常的細胞凍存液要高。

3 從上表可以看出,原代、次代細胞經(jīng)凍存后,復蘇的存活率為零,具體原因有待于今后進一步探討。

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